Nº 417. C. E. Procés de descripció d'una nova espècie

 Copiat de l'article de l'Espeleobloc del 4 d'octubre del 2012.

 Procès de descripció d'una nova espècie

En Carles Fontgivell en una dificil situació cercant fauna. Ifri Taouya, Marroc

Introducció: 

En molts articles biospeleològics es parla de descobriments de noves espècies per a la ciència. Això vol dir que s'ha trobat un espècimen que per les seves característiques morfològiques s'ha de posicionar com a una espècie diferent a les seves més properes. Explicarem tots els passos que s'han de fer fins arribar a la determinació de que es tracta d'una nova espècie i al fins publicar els resultats. El procés pot semblar molt normal i relativament senzill, però intentarem analitzar-ho amb més profunditat. L'exemple que es descriu en aquest article, es basarà en la troballa d'un nou coleòpter cavernícola.

 

Hi ha llocs més adients... per a la recerca. Cova del Toll, Moià

Per arribar a la conclusió de que s'ha trobat una nova espècie, s'ha de seguir un llarg camí que comença generalment amb la captura dels exemplars, passa pel seu estudi morfològic, i avui dia en moltes ocasions també amb l'anàlisi de l'ADN i una explicació de les característiques de la cavitat, seguint amb l'edició d'un treball descriptiu i comparatiu i acabant amb la publicació en una revista especialitzada.

El primer pas, la captura:

Pot ser que en el moment de la captura veiem, o ens ho sembli, que es tracta d'exemplars que tenen una forma quelcom diferent a la típica de l'espècie que viu a la zona. Pot ser més gran, més petita, etc. Això ja és un primer indicatiu, tot i que ens hem portat molts disgustos per fer massa suposicions.

Des del moment de la captura, és importantíssim la conservació i etiquetat del material, serà la manera d'assegurar que es mantingui en bones condicions pel seu posterior estudi. Els coleòpters que habitualment recollim dins les cavitats, es conserven en alcohol etílic rebaixat a 70º, però si al moment de la captura es considera que pot ser un material important, se'n conserven un parell d'exemplars en alcohol etílic de 96º per, si escau, poder fer un posterior anàlisi de l'ADN.

Floren Fadrique capturant fauna amb l'ajud de l'aspirador

 

Primera visió sota la lupa binocular d'uns coleòpters cavernícoles del gènere Aphaenops d'Escuaín, Osca

Primera visió sota la lupa binocular:

Una vegada a casa o al museu, el material s'examina sota el binocular per treure'n una primera conclusió. Si escau, es compara amb el material de col·leccions particulars, o del museu, per poder establir provisionalment si es tracta d'una espècie coneguda o no. Si es creu que es tracta d'una espècie amb possibilitats de ser nova, es busca un especialista per fer l'estudi definitiu.

Al fons, Carles Hernando, un dels nostres col·laboradors habituals en els estudis. En primer pla Francesc Alfambra.

Altres dos estudiosos habituals: En primer pla, Oleguer Escolà. Al fons, Jordi  Comas.    Foto: Laboratori d'Artròpodes del Museu de Ciències Naturals de Barcelona

Elecció de l'especialista per l'estudi:

En el nostre cas, disposem de molts professionals i aficionats altament especialitzats en les diferents famílies de coleòpters subterranis-cavernícoles, molts d'ells catalans, així com altres de l'estat i també d'estrangers:  Jordi Comas; Joaquim Mateu; Oleguer Escolà; Carles Hernando; Javier Fresneda;  Pere Oromi; Vicente Ortuño, etc. Entre els d'altres països: Arnaud Faille, del Muséum des Sciences Naturelles de París; Peter E. Stüben, del Curculio Institute de Munich, etc.

Cadascun d'ells està especialitzat en un o varis grups, i segons el seu interès i la seva disponibilitat poden acceptar l'encàrrec de l'estudi. També és habitual el treball conjunt entre varis d'ells, en especial si es tracta de treballs de revisions de grups, o els que exigeixen activitats de camp i visites a cavitats, o anàlisi dels ADN, etc. Per exemple, si s'ha d'estudiar un coleòpter estafilínid, un dels més adequats seria en Carles Hernando; Si fos un coleòpter curculiònid, ho proposaríem a Peter Stüben, etc.

Si el material ha estat dipositat al museu, com és el cas de treballs subvencionats per ell, l'especialista ha de demanar oficialment el material per al seu estudi, comprometen-se a la seva devolució una vegada acabada la feina (si hi ha varis exemplars, l'autor de la descripció se'n sol quedar algun exemplar). Si el material prové d'un treball del tot particular, no és necessari aquest tràmit, tot i que part del material estudiat s'entrega al museu per completar les seves col·leccions.

Miquel Prieto -esquerra- i Jordi Agulló dins del Laboratori d'Artròpodes del museu

Estudi definitiu:

En cas de dubtes serà necessari primer de tot extreure la genitalia masculina i/o femenina per assegurar les conclusions. Hi ha espècies que per fora són quasi idèntics, sigui en mascles com en femelles (hi sol haver més diferències entre mascles)  i en aquest cas s'ha d'extreure la genitalia per veure quines diferències hi poden haver.

Preparació del material:

Aquesta operació pot fer-se abans del lliurament del material a l'especialista, o bé fer-ho ell directament. (extraccions de genitalies i preparació del material en sec).

Extretes les genitalies: el material capturat s'ha de preparar per al seu posterior estudi. Primerament es trauran els òrgans adients. Les genitalies es conserven dins de resina sintètica (DMHF).  Els exemplars es preparen en sec encolats sobre petites cartolines blanques, és una feina que exigeix bona ma i un pols molt controlat, ja que s'han de col·locar les potes i antenes en una posició igual a quan eren vius. A vegades una antena pot mesurar dues o tres dècimes de mil·límetre i s'ha d'adressar i deixar en una posició molt concreta a base de manipular-la amb una agulla o el pel d'un pinzell molt fi.

Comparació taxonòmica:

Es tracta de veure si hi ha diferències d'aspecte entre els exemplars trobats i els ja coneguts i ben determinats de les col·leccions del museu o de les particulars dels especialistes. Pot donar-se el cas que es necessiti material de comparació que està en determinat museu o col·lecció. Llavors l'especialista o el museu el demana oficialment, també amb el compromís de la seva devolució en acabar l'estudi.

Dues espècies diferents però amb aspecte semblant: Trechus sendrai -esquerra-. Trechus djebalica -dreta-. La genitalia ens dirà més coses

Comparació de genitalies:

És un treball molt delicat, ja que segons la posició resultant dins la preparació microscòpica, pot donar imatges diferents i portar a interpretacions errònies. Més complicacions hi ha en la genitalia femenina per la delicadesa dels òrgans, que poden no arribar a una dècima de mm.

 

Genitalies masculines de les dues espècies, en visió lateral: T. sendrai -a dalt- i T. djebalica -a baix. Aqui sí que ja hi veiem més diferències que ens permetes la diferenciació

 

Peçes dels organs genitals femenins de diferents espècies de coleòpters cavernícoles del gènere Apteranillus del Marroc

 

Una de les caixes de la colecció de coleòpters cavernícoles del museu. Aquest material serveix de comparació durant l'estudi morfològic

Anàlisi de l'ADN:

Hi ha ocasions que les poques diferenciacions entre espècies ho fan dificultós de separar. Ara es pot treballar amb les comparacions dels ADN, un aspecte que està prenent una gran importància en els actuals treballs. Si un estudi morfològic està a les mans d'un especialista, no ho és així un estudi genètic.

Per poder fer l'extracció; amplificació; processat, etc, es fa necessari un equip altament especialitzat que només està a la mà d'uns pocs organismes oficials. Així doncs, en aquest cas serà obligada la col·laboració en el treball descriptiu, d'un especialista en genètica que pugui estar disponible per treballar-hi conjuntament En el nostre cas, generalment és el Dr Ignacio Ribera de l'Institut de Biologia Evolutiva (CSIC) de Barcelona, el que sempre ens ha donat suport i ha col·laborat en aquesta recerca.

Per analitzar, en teoria es necessita un sol exemplar, tot i que per seguretat, se'n guarden dos per si hi ha alguna "maniobra fallida". En el cas que només es conegui un exemplar que es suposi pot ser una nova espècie, l'extracció de l'ADN s'ha de practicar, en primer lloc i abans de la seva preparació sobre cartolina. 

Part de l'equip d'extracció i anàlisi de l'ADN. Laboratori de l'Institut de Biologia Evolutiva de Barcelona (CSIC)

Un "arbre" resultant de l'estudi dels ADN de l'article  Ancient origin of a Western Mediterranean radiation of subterranean beetles. Ignacio Ribera; Javier Fresneda i 5 co-autors més. BMC Evolutionary Biology 2010, 10:29

Nom de la nova espècie:

El nom és potestat de l'autor/s de la descripció. Dins dels molts casos, en citarem els més habituals:

-Es pot dedicar a la persona que ha fet la primera captura o a un dels components del grup que la va trobar, com Bellesia espanyoli, un coleòpter Cholevidae d'Osca. El gènere Bellesia es va dedicar al Dr. Xavier Bellés i l'espècie al Dr. Francesc Español

-Es pot dedicar al nom d'un club o grup espeleològic. P. ex. Apteranillus minosianus, un estafilínid del Marroc Central que es va dedicar al grup Minos de París. Es pot donar el nom de la regió, província país, etc, com p. ex. Paranillochlamys catalonicus, un Leiodidae: Cholevinae: Leptodirini, de Tarragona

-Es pot donar un nom derivat d'alguna característica molt destacada del nou insecte. Per exemple, el coleòpter Speonomus ellipticus, dels voltants de Serradell, derivat del seu contorn marcadament el·líptic.

 

Fotografies i/o dibuixos:

Són imprescindibles les representacions amb la màxima fidelitat. Avui dia hi ha una relativa facilitat per poder fotografiar un exemplar preparat sobre cartolina. Programes com COMBINE Z5 o HELICON FOCUS. Més delicat és la foto de les genitalies per la seva mida quasi microscòpica. Ara ja, en poques ocasions s'editen dibuixos. Una altra història són les fotos amb microscopi electrònic. Són perfectes per mostrar porus, puntuacions, conductes sensorials i detalls que només poden veure's amb grans ampliacions. El problema és que aquests equips no estan accessibles a tothom. També s'han de preparar mapes de situació de la localitat típica i distribució de la nova espècie i/o espècies que es prenen de comparació.

Una de les modalitats és dibuixar l'espècie que es descriu. Trechus cifrianae de cavitats d'Astùries

 

Torneuma troglodytis de la cova Kek Aziza del Marroc.    Foto: Curculio Institute

 

Fotografia  amb el programa COMBINE, del Troglocharinus ferreri -sense preparar-.   Foto: Agustí Meseguer

Fotografia amb microscopi electrònic. Cap d'un coleòpter cavernícola del gènere Anophtalmus. Foto: font d'Internet

Preparació del treball definitiu:

Només queda organitzar totes les dades i escrits; fer el resum, ordenar i trobar un medi d'edició. Des de l'inici de l'estudi fins l'aparició "en premsa" pot passar entre un i dos anys, tret d'algunes excepcions. Hi ha casos en que l'estudi es pot perllongar varis anys degut a que es necessita més material d'una determinada espècie que només es troba en una cavitat i que per raons de sequera o altres causes, no hi ha manera de trobar-la per més visites que es facin.

Publicació en una revista especialitzada:

Hi ha revistes que encara s'imprimeixen sobre paper (que després es poden consultar "on line", tot i que cada vegada tenen més tendència les de format només digital. Aquí tenim quatre exemples de les moltes que publiquen descripcions de noves espècies cavernícoles, ja que un llistat complert seria massa llarg:

-Animal Biodiversity and Conservation. És la revista que publica el Museu de Ciències Naturals de Barcelona i s'edita semestralment en paper  (Des de 1958 fins al 2000 es publicava amb el nom de Miscel·lània Zoològica) i pot ser consultada lliurament per Internet

-Heteropterus Revista de Entomología de la Asociación Guipuzkoana de Entomología de Hernani, Guipuzkoa, que s'edita semestralment en paper i pot ser consultada lliurament per internet

-Annales de la Société Entomologique de France, editada per  la Société Entomologique de France, París, que s'edita cada tres mesos en paper i pot ser consultada lliurament per Internet

-Zootaxa. Una revista digital editada des de Nova Zelanda. Les seves edicions són cada pocs dies. Es poden descarregar lliurement els resums, i en alguns casos tot el treball, depenent de les condicions inicials entre l'autor i l'editor. De totes maneres es pot comprar un treball per descarregar-lo 

Diversos números de la revista Animal Biodiversity and Conservation editada pel museu de Barcelona

Portada d'un exemplar de la revista Heteropterus revista de Entomología

El procés exposat és només un exemple teòric, tot i que és molt proper a la pràctica. En varis apartats ho podríem complicar més, però del que es tracta és de fer comprendre els passos fonamentals d'aquest estudi científic.

Nº 414. C. E. Estudis genètics de la fauna subterrània

Article copiat del bloc Espeleobloc, del dia 8 de desembre del 2008.

Mètode de comparació de les seqüències d'ADN en coleòpters cavernícoles.

Introducció:

He tingut la sort de poder contactar amb científics, alguns d'ells espeleòlegs, que estan treballant al CSIC, dins de l'Institut de Biologia Evolutiva de Barcelona.

El Dr. Ignacio Ribera és el cap d'investigació, entre altres, del projecte Filogènia i Biogeografia dels coleòpters cavernícoles i endogeus de la Mediterrània (es poden consultar els projectes i els treballs publicats a la pàgina web http://molevol.cmima.csic.es/ribera/cave.html), en què a més dels aspectes externs dels espècimens, també es comparen els genètics: els seus ADN.

Un dels seus col·laboradors és el Dr Arnaud Faille, un biòleg-espeleòleg francès del Muséum National d'Histoire Naturelle (París), que està fent un estudi post-grau sobre l'Evolució de les espècies cavernícoles Ibèriques dels Trechinae i Leptodirini. En el post Expedició Win Timdouine 2008 de l'Espeleobloc del 14-nov-2008, ja hi havia referències d'aquest investigador i del seu projecte.

Es va demanar permís, que molt amablement concediren, per poder fer un reportatge "in situ" de com s'elabora pràcticament el procés d'obtenció i estudi de l'ADN.

Tradicionalment, l'estudi de molts artròpodes s'havia anat fent, primer per la comparació de les formes de diferents òrgans, mides, proporcions geomètriques, per anar entrant a finals del segle XIX amb els estudis de la forma de l'orgue copulador del mascle i més recentment del sac vaginal de la femella, o sigui, que sempre ha estat el que es diu un estudi morfològic. Recentment, s'estan canviant els sistemes de comparació, s'ha fet un salt en la investigació, entrant dins la part més profunda de qualsevol individu: El seu "codi genètic". Així doncs, ara es poden agrupar espècies que des de fora es veuen molt distants o pel contrari separar-ne algunes que semblen molt properes.

 

L'Arnaud ha fet un escrit per l’Espeleobloc, que he traduït i adaptat a un grau de fàcil comprensió pels que no som científics.

Fauna subterrània i estudi genètic

Els organismes troglobis sovint són citats a títol d'exemple per il·lustrar els fenòmens de convergència de la seva forma externa, és a dir, els caràcters considerats com adaptacions morfològiques al medi subterrani. Però quina és la part real de la convergència en el conjunt de les semblances externes dels insectes? Com identificar els lligams de parentesc entre aquest animals si les seves formes reals estan dissimulades per les adaptacions a la vida subterrània? Llavors és de gran utilitat tenir el recurs de l'ADN.

L'estudi del material genètic d'aquests organismes permet trobar la genealogia de les espècies, i al mateix temps identificar la importància real de la convergència dins les similituds dels animals cavernícoles. Nosaltres treballem, entre altres, sobre dos grans grups de coleòpters que s'han anat diversificant dins del medi subterrani: La subfamília Trechinae i la tribu Leptodirini.

Les espècies amb què treballem estan en la seva gran majoria molt localitzades o molt difícils de recol·lectar, com és molt habitual en un gran nombre d'organismes subterranis. És necessari visitar moltes vegades les cavitats d'on estan citats i així i tot, moltes encara es resisteixen a ser capturades o només se'n troba un. Així doncs, per extreure l'ADN apliquem un mètode no destructiu que permet la conservació intacte de l'espècimen pel seu posterior estudi morfològic o per passar a enriquir el material de les col·leccions entomològiques. A més, amb un sol exemplar, indistintament mascle o femella, és suficient.

Procés d'obtenció de l'ADN:

1- Si es captura viu l'insecte, immediatament se l’ha d'introduir en un tub amb alcohol (etanol) de 95 o 96º, per preservar l'ADN. També es pot seguir el sistema de cacera amb trampes de líquid especial que també conserva l'ADN. Com en tota recol·lecció entomològica, recordem que sempre s'ha de referenciar la captura escrivint les dades de lloc de la troballa, data, nom del recol·lector i de molta utilitat són també l'altitud del lloc, coordenades GPS amb indicació   del "dàtum" en què han estat preses i condicions de l'hàbitat.

2- Ja al laboratori, amb molta delicadesa a l'espècimen se li practica una petita incisió entre els segments abdominals amb la finalitat de què els enzim digestius puguin accedir amb més facilitat als teixits interns. Tot seguit s'asseca i es diposita sencer durant tota una nit a una temperatura d'uns 55º dins d'un bany a base d'un tampó de digestió i de l'enzim Proteïnasa K. Aquest aparell rep el nom d'Estufa de digestió, ja que els enzims del bany es mengen i digereixen la grassa i la proteïna, deixant tot l'ADN de la mostra dissolt al bany i deixant intacte tota la cutícula, la part externa de l'insecte. L'endemà l'insecte ja ha perdut la rigidesa provocada per la seva primera conservació en alcohol de 96º. Es deixa assecar i tot seguit ja es pot preparar encolat sobre una cartolina pels eventuals estudis morfològics.

3- L'ADN ja ha quedat extret de l'insecte i ha passat al bany. El líquid resultant es tracta per ser purificat, separant-li les restes de proteïnes i altres molècules. S'obté l'ADN pur que es pot conservar dins d'un congelador a temperatura d'uns -20º i repetir assaigs en altres segments, donar-ne a altres centres d'estudi, etc.

4- Ara és necessari crear una gran quantitat de còpies del gen que es vol estudiar o comparar. Segons el motiu de l'estudi; (afinitats entre dues poblacions d'una mateixa espècie, entre dos gèneres diferents, etc.), s'analitzen segments de diferents zones de la cadena de l'ADN. No tots els gens evolucionen a la mateixa velocitat i per això s'ha d'escollir quins es volen estudiar. Ara s'utilitza la tècnica de la Polymerase Chain Reaction (PCR) dins d'un aparell anomenat "Termociclador" que reprodueix un cicle programat a temps i temperatures variables.

5- Obtingudes les múltiples còpies dels segments desitjats, s'ha de verificar que, en efecte, aquesta operació s'ha fet amb èxit. Es comprova amb un equip d'electroforesi i un gel d'agarosa. Si l'operació és correcta, apareixen les bandes genètiques que són visibles sota la incidència de llum d'una determinada freqüència i poden ser fotografiades.

6- Els segments amplificats s'envien a laboratoris especialitzats que mitjança la introducció d'uns marcadors i lectura per làser, ens proporcionen una sèrie de quatre gràfics corresponents a la distribució dels seus quatre elements constituents: Adenina, Timina, Guanina i Citosina (ATGC).

7- Amb un programa informàtic es comprova si hi ha errors o ambigüitats i després s'obté la seqüència final. Les seqüències del mateix fragment de gen dels diversos exemplars es combinen en una única matriu de caràcters que és la que s'utilitzarà en els programes d'anàlisi filogenètics per establir les relacionen evolutives entre diferents poblacions, espècies, gèneres, etc. segons es desitgi estudiar. També es poden combinar els resultats moleculars i morfològics en una única anàlisi conjunta.

Al final s'obté un "arbre" amb la filogènia molecular dels diferents grups estudiats amb les indicacions de proximitat (línies horitzontals més llargues indiquen més separació genètica).

Tots hi podem col·laborar: 

Una de les principals dificultats d'obtenir fauna subterrània, és la recol·lecció del material dins del seu ambient, el medi subterrani. Des d'aquí fem una crida a la col·laboració de tots els espeleòlegs interessats en aquest tema. Si voleu conèixer quins animals viuen dins d'una cavitat que esteu explorant, si durant un temps d'espera a l'extrem de la corda per què pujareu o asseguts a prop d'un sifó ple d'aigua veieu passar algun petit animaló que us pot semblar un insecte cavernícola, el preneu i poseu dins d'un petit tub! Nosaltres estem particularment interessats en els espècimens que podrien ser recol·lectats durant les exploracions esportives a les xarxes de les grans cavitats, ja que és una zona en què la fauna és molt poc coneguda pel fet de les altes dificultats tècniques d'accés. No hi ha problema amb el material de cacera. Podem subministrar lliurement tubs amb alcohol i d'altre material si se n's demana.

Arnaud Faille. Institut de Biologia Evolutiva (CSIC)

Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003 Barcelona.

NOTA: L'Arnaud ens va facilitar l'escrit i la visita a finals de l'any 2008, quan treballava a l'Institut.