Nº 414. C. E. Estudis genètics de la fauna subterrània

Article copiat del bloc Espeleobloc, del dia 8 de desembre del 2008.

Mètode de comparació de les seqüències d'ADN en coleòpters cavernícoles.

Introducció:

He tingut la sort de poder contactar amb científics, alguns d'ells espeleòlegs, que estan treballant al CSIC, dins de l'Institut de Biologia Evolutiva de Barcelona.

El Dr. Ignacio Ribera és el cap d'investigació, entre altres, del projecte Filogènia i Biogeografia dels coleòpters cavernícoles i endogeus de la Mediterrània (es poden consultar els projectes i els treballs publicats a la pàgina web http://molevol.cmima.csic.es/ribera/cave.html), en què a més dels aspectes externs dels espècimens, també es comparen els genètics: els seus ADN.

Un dels seus col·laboradors és el Dr Arnaud Faille, un biòleg-espeleòleg francès del Muséum National d'Histoire Naturelle (París), que està fent un estudi post-grau sobre l'Evolució de les espècies cavernícoles Ibèriques dels Trechinae i Leptodirini. En el post Expedició Win Timdouine 2008 de l'Espeleobloc del 14-nov-2008, ja hi havia referències d'aquest investigador i del seu projecte.

Es va demanar permís, que molt amablement concediren, per poder fer un reportatge "in situ" de com s'elabora pràcticament el procés d'obtenció i estudi de l'ADN.

Tradicionalment, l'estudi de molts artròpodes s'havia anat fent, primer per la comparació de les formes de diferents òrgans, mides, proporcions geomètriques, per anar entrant a finals del segle XIX amb els estudis de la forma de l'orgue copulador del mascle i més recentment del sac vaginal de la femella, o sigui, que sempre ha estat el que es diu un estudi morfològic. Recentment, s'estan canviant els sistemes de comparació, s'ha fet un salt en la investigació, entrant dins la part més profunda de qualsevol individu: El seu "codi genètic". Així doncs, ara es poden agrupar espècies que des de fora es veuen molt distants o pel contrari separar-ne algunes que semblen molt properes.

 

L'Arnaud ha fet un escrit per l’Espeleobloc, que he traduït i adaptat a un grau de fàcil comprensió pels que no som científics.

Fauna subterrània i estudi genètic

Els organismes troglobis sovint són citats a títol d'exemple per il·lustrar els fenòmens de convergència de la seva forma externa, és a dir, els caràcters considerats com adaptacions morfològiques al medi subterrani. Però quina és la part real de la convergència en el conjunt de les semblances externes dels insectes? Com identificar els lligams de parentesc entre aquest animals si les seves formes reals estan dissimulades per les adaptacions a la vida subterrània? Llavors és de gran utilitat tenir el recurs de l'ADN.

L'estudi del material genètic d'aquests organismes permet trobar la genealogia de les espècies, i al mateix temps identificar la importància real de la convergència dins les similituds dels animals cavernícoles. Nosaltres treballem, entre altres, sobre dos grans grups de coleòpters que s'han anat diversificant dins del medi subterrani: La subfamília Trechinae i la tribu Leptodirini.

Les espècies amb què treballem estan en la seva gran majoria molt localitzades o molt difícils de recol·lectar, com és molt habitual en un gran nombre d'organismes subterranis. És necessari visitar moltes vegades les cavitats d'on estan citats i així i tot, moltes encara es resisteixen a ser capturades o només se'n troba un. Així doncs, per extreure l'ADN apliquem un mètode no destructiu que permet la conservació intacte de l'espècimen pel seu posterior estudi morfològic o per passar a enriquir el material de les col·leccions entomològiques. A més, amb un sol exemplar, indistintament mascle o femella, és suficient.

Procés d'obtenció de l'ADN:

1- Si es captura viu l'insecte, immediatament se l’ha d'introduir en un tub amb alcohol (etanol) de 95 o 96º, per preservar l'ADN. També es pot seguir el sistema de cacera amb trampes de líquid especial que també conserva l'ADN. Com en tota recol·lecció entomològica, recordem que sempre s'ha de referenciar la captura escrivint les dades de lloc de la troballa, data, nom del recol·lector i de molta utilitat són també l'altitud del lloc, coordenades GPS amb indicació   del "dàtum" en què han estat preses i condicions de l'hàbitat.

2- Ja al laboratori, amb molta delicadesa a l'espècimen se li practica una petita incisió entre els segments abdominals amb la finalitat de què els enzim digestius puguin accedir amb més facilitat als teixits interns. Tot seguit s'asseca i es diposita sencer durant tota una nit a una temperatura d'uns 55º dins d'un bany a base d'un tampó de digestió i de l'enzim Proteïnasa K. Aquest aparell rep el nom d'Estufa de digestió, ja que els enzims del bany es mengen i digereixen la grassa i la proteïna, deixant tot l'ADN de la mostra dissolt al bany i deixant intacte tota la cutícula, la part externa de l'insecte. L'endemà l'insecte ja ha perdut la rigidesa provocada per la seva primera conservació en alcohol de 96º. Es deixa assecar i tot seguit ja es pot preparar encolat sobre una cartolina pels eventuals estudis morfològics.

3- L'ADN ja ha quedat extret de l'insecte i ha passat al bany. El líquid resultant es tracta per ser purificat, separant-li les restes de proteïnes i altres molècules. S'obté l'ADN pur que es pot conservar dins d'un congelador a temperatura d'uns -20º i repetir assaigs en altres segments, donar-ne a altres centres d'estudi, etc.

4- Ara és necessari crear una gran quantitat de còpies del gen que es vol estudiar o comparar. Segons el motiu de l'estudi; (afinitats entre dues poblacions d'una mateixa espècie, entre dos gèneres diferents, etc.), s'analitzen segments de diferents zones de la cadena de l'ADN. No tots els gens evolucionen a la mateixa velocitat i per això s'ha d'escollir quins es volen estudiar. Ara s'utilitza la tècnica de la Polymerase Chain Reaction (PCR) dins d'un aparell anomenat "Termociclador" que reprodueix un cicle programat a temps i temperatures variables.

5- Obtingudes les múltiples còpies dels segments desitjats, s'ha de verificar que, en efecte, aquesta operació s'ha fet amb èxit. Es comprova amb un equip d'electroforesi i un gel d'agarosa. Si l'operació és correcta, apareixen les bandes genètiques que són visibles sota la incidència de llum d'una determinada freqüència i poden ser fotografiades.

6- Els segments amplificats s'envien a laboratoris especialitzats que mitjança la introducció d'uns marcadors i lectura per làser, ens proporcionen una sèrie de quatre gràfics corresponents a la distribució dels seus quatre elements constituents: Adenina, Timina, Guanina i Citosina (ATGC).

7- Amb un programa informàtic es comprova si hi ha errors o ambigüitats i després s'obté la seqüència final. Les seqüències del mateix fragment de gen dels diversos exemplars es combinen en una única matriu de caràcters que és la que s'utilitzarà en els programes d'anàlisi filogenètics per establir les relacionen evolutives entre diferents poblacions, espècies, gèneres, etc. segons es desitgi estudiar. També es poden combinar els resultats moleculars i morfològics en una única anàlisi conjunta.

Al final s'obté un "arbre" amb la filogènia molecular dels diferents grups estudiats amb les indicacions de proximitat (línies horitzontals més llargues indiquen més separació genètica).

Tots hi podem col·laborar: 

Una de les principals dificultats d'obtenir fauna subterrània, és la recol·lecció del material dins del seu ambient, el medi subterrani. Des d'aquí fem una crida a la col·laboració de tots els espeleòlegs interessats en aquest tema. Si voleu conèixer quins animals viuen dins d'una cavitat que esteu explorant, si durant un temps d'espera a l'extrem de la corda per què pujareu o asseguts a prop d'un sifó ple d'aigua veieu passar algun petit animaló que us pot semblar un insecte cavernícola, el preneu i poseu dins d'un petit tub! Nosaltres estem particularment interessats en els espècimens que podrien ser recol·lectats durant les exploracions esportives a les xarxes de les grans cavitats, ja que és una zona en què la fauna és molt poc coneguda pel fet de les altes dificultats tècniques d'accés. No hi ha problema amb el material de cacera. Podem subministrar lliurement tubs amb alcohol i d'altre material si se n's demana.

Arnaud Faille. Institut de Biologia Evolutiva (CSIC)

Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003 Barcelona.

NOTA: L'Arnaud ens va facilitar l'escrit i la visita a finals de l'any 2008, quan treballava a l'Institut.